Bisulfit-sekvensering – metode for DNA-metylasjonsanalyse

Bisulfit-sekvensering er en molekylærbiologisk metode for å kartlegge DNA-metylasjon (5-metylcytosin) med enkeltbaseoppløsning. Princippet: natriumbisulfit konverterer u-metylert cytosin til uracil (leses som thymidin etter PCR), mens 5-metylcytosin er beskyttet og forblir som cytosin.

Fremgangsmåte

1. Denaturering av DNA (enkeltstreng).
2. Behandling med natriumbisulfit (høyt salt, varme).
3. Desulfonering og rensing.
4. PCR-amplifikasjon med primere spesifikke for konvertert streng.
5. Sekvensering (Sanger eller NGS) og bioinformatisk analyse for å identifisere metylerte CpG-dinukleotider.

Utfordringer

• Høyt saltkrever annealing, men kan hindre fullstendig konvertering → falske positive metylasjonssignaler.
• Denatureringsmidler (heat, alkali) brukes for å redusere dsDNA-beskyttelse.
• DNA-degradasjon under hard behandring – lav startmengde kan være problematisk.
• Ikke egnet for RNA (har naturlig uracil).

Anvendelse

Epigenetisk forskning: genregulering, kreft, utviklingsbiologi. Klinisk: biomarkerutvikling, legemiddelmål. Krever minimalt materiale – egnet for biopsipraver.