Ubiquitinmolekyler Protein & Dens Detection Methods

Ubiquitin er en svært konservert polypeptider, som blir dannet ved 76 aminosyrerester. Den kan kovalent koble med en eller flere lysinrester på den intracellulære målproteinet under forutsetning av enzymatiske reaksjoner katalyserer. Ubiquitin i seg selv inneholder syv lysinrester, som også kan kobles til hverandre for å danne en multi-ubiquitin kjeder (polyubiquitin kjede). Den foreliggende undersøkelse viser at dersom de første 48 lysinrester polyubiquitin kjede og som er koblet til det modifiserte protein vil mediere målproteinet til proteosomet og er degradert; hvis proteinet er modifisert med andre områder, for eksempel de første 63 lysinresidier knyttet til målet protein signalveien funksjonen kan spille uten å bli degradert.

tilnærminger for å avdekke ubiquitinmolekyler

Før denne deteksjons bør vi først vite følgende tre punkter:

1. Proteiner, som har blitt ubiquitinmolekyler.
To. Lysinresidiet, som skjedde ubiquitinering.
Tre. Ubiquitinering prediksjon

Så målene for påvisning er at det molekylære effekter er produsert av ubiquitinmolekyler og dens effekt på nedstrøms signalveier

De metoder og prosesser for innhold ovenfor:.
< p> Western blot og bånd

Oppdager ubiquitinmolekyler protein band med western blot og stripping membranen, noe som bør registreres med bilder. Og så bør det reagere med spesifikke proteiner antistoffer og spesifikke ubiquitinering nettsteder antistoffer, som farge vil bli registrert. Ved å sammenligne de positive band til å bedømme forekomst av protein ubiquitinering til et bestemt sted foreløpig.

Western blot og immunoprecipitation

For å skille de spesielle proteiner og proteiner, som er kombinert med spesielle proteiner ved hjelp av co-immunoprecipitation. Og deretter separerte proteiner bør analyseres ved hjelp av SDS og western blot. Denne metoden kan gjøre det klart at som lysinresidiet av visse proteiner har oppstått ubiquitylation.

In vitro ubiquitinering analysen

trans målet gener med 293 celler for å gjøre det uttrykke overflod. Og så er rettet mot proteiner vil bli trukket ut i løpet av 24 timer. In vitro reaksjon buffer, bør vi ruge ubiquitinmolekyler og protein forårsaker protein A ubiquitinering med UBE1, UbeH13-Uev en en heterodimerkompleksdannelse og HA-ubiquitin. Produktene bør analyseres av IP og WB. Denne metoden kan vise E3 ligase, som forårsaker proteiner som forårsaker protein ubiquitinering.

In vitro ubiquitin-bindingsanalysen

trans target proteiner med 293 celler. Og rense den etter sin rike uttrykk eller trekke endogene proteiner direkte. Og så ruger det med K63- eller K48-koblede ubiquitin kjede petides in vitro. Etter som skal påvises med SDS og ubiquitin-antistoffer. Denne metoden brukes til å bestemme lysinresidier, som er lett å bli ubiquitinmolekyler.

Dette er fire metoder for å påvise protein ubiquitinering.